NộI Dung
Một màu xanh di truyền tế bào di động được mã hóa trong vật liệu di truyền của nó, hoặc DNA. Vì DNA không bao giờ rời khỏi nhân của tế bào, để thông tin này đi vào tế bào chất nơi các protein và các thành phần sinh hóa khác cư trú, trước tiên cần phiên mã DNA thành RNA thông tin (mRNA hoặc poly (A) RNA). MRNA này sau đó được dịch thành protein thực hiện nhiều chức năng của tế bào. Để phát hiện hoặc định lượng các mRNA rất hiếm, tạo các đầu dò cho các vi mô hoặc xây dựng các thư viện của các phân tử DNA bổ sung, mRNA phải được cách ly. Tuy nhiên, trích xuất RNA tổng số (tức là tất cả các RNA trong một tế bào) và phân lập mRNA tiếp theo không phải là các quá trình loại trừ lẫn nhau; trước đây phải được thực hiện để trích xuất mRNA.
Phân lập mRNA từ RNA tổng số
Đồng hóa TRIzol: RNA tổng số bao gồm tất cả mRNA, RNA chuyển, RNA ribosome và RNA không mã hóa khác. Để tách chúng khỏi các thành phần tế bào khác, trước tiên, ô được mở để giải phóng nội dung của nó. Điều này được thực hiện bằng cách nối lại các tế bào được chia thành từng phần bằng cách ly tâm (quay với tốc độ cao) trong TRIzol Reagent (Life Technologies). Các phiên bản khác của TRIzol (chẳng hạn như Thuốc thử Ambion TRI TRI) hoạt động tương tự.
Cách ly RNA tổng số: Một loạt các máy ly tâm được sử dụng để tách các thành phần khác nhau (protein, DNA, RNA) của tế bào thành các lớp, hoặc các pha, trong huyền phù. Pha trên cùng, màu vàng bao gồm chất béo và có thể được loại bỏ. Pha mong muốn có màu đỏ, chứa tổng số RNA và được giữ lại. Sau khi thực hiện chiết xuất phenol-chloroform và một loạt dung dịch rửa bằng cồn sử dụng isopropanol và ethanol, RNA có thể được tách ra để phân lập mRNA. Thêm chất ức chế RNase để ngăn chặn enzyme này làm suy giảm tổng số RNA.
Trích xuất mRNA: Người ta thường sử dụng một bộ để cô lập các mRNA, vì các giao thức trong phòng thí nghiệm tự chế không tạo ra số lượng lớn các mRNA có độ tinh khiết cao. Các bộ dụng cụ thương mại bao gồm Invitrogen từ FastTrack 2.0 hoặc Ambion lề Poly (A) Bộ cách ly mRNA tinh khiết. Những bước cơ bản này là phổ biến cho các bộ dụng cụ như vậy:
a) Trộn dung dịch đệm ly giải bị ức chế RNase được cung cấp trong bộ dụng cụ với tối đa 300 microlit của RNA tổng số.
b) Đun nóng trong 5 phút ở 65 độ C và sau đó làm lạnh ngay lập tức mẫu trên băng trong một phút.
c) Trộn hỗn hợp này với natri clorua 0,5M và sau đó hòa tan hoàn toàn Oligo dT (axit oligodeoxythymidylic) trong mẫu này.
d) Ly tâm mẫu này và thu hồi phần nổi phía trên, được rửa nhiều lần trong một loạt các chất đệm liên kết và muối thấp được cung cấp trong bộ dụng cụ.
e) Rửa giải mRNA nhiều lần cho đến khi đạt được thể tích theo bộ (ví dụ 500 microliter).
f) Kết tủa rửa giải bằng kết tủa natri axetat và etanol. Đình chỉ lại trong tối đa 20 microlit của nước đã qua xử lý diethylpyrocarbonate (DEPC).
g) Bảo quản ở -80 độ C và kiểm tra chất lượng và số lượng bằng phương pháp quang phổ.