NộI Dung
- Các trang web hạn chế và các trang web hạn chế
- Định hướng đúng
- Ligating kết thúc dính yêu cầu ít DNA
- Các enzyme khác nhau có thể cho cùng một kết thúc dính
Nhân bản phân tử là một phương pháp công nghệ sinh học phổ biến mà mọi sinh viên và nhà nghiên cứu nên làm quen. Nhân bản phân tử bằng cách sử dụng một loại enzyme gọi là enzyme cắt giới hạn để cắt DNA của con người thành các đoạn mà sau đó có thể được đưa vào DNA plasmid của tế bào vi khuẩn. Enzim hạn chế cắt DNA sợi đôi làm đôi. Tùy thuộc vào enzyme hạn chế, vết cắt có thể dẫn đến kết thúc dính hoặc kết thúc cùn. Các đầu dính có ích hơn trong nhân bản phân tử vì chúng đảm bảo rằng đoạn DNA của con người được đưa vào plasmid theo đúng hướng. Quá trình thắt, hoặc hợp nhất các đoạn DNA, đòi hỏi ít DNA hơn khi DNA có kết thúc dính. Cuối cùng, nhiều enzyme giới hạn đầu dính có thể tạo ra cùng một đầu dính, mặc dù mỗi enzyme nhận ra một chuỗi hạn chế khác nhau. Điều này làm tăng khả năng khu vực DNA quan tâm của bạn có thể bị cắt bởi các enzyme kết thúc dính.
Các trang web hạn chế và các trang web hạn chế
Enzim hạn chế là các enzyme cắt nhận ra các trình tự cụ thể trên DNA sợi kép và cắt DNA một nửa ở trình tự đó. Trình tự được công nhận được gọi là trang web hạn chế. Các enzyme hạn chế được gọi là endonuclease vì chúng cắt DNA sợi đôi, đó là cách DNA thường tồn tại, tại các vị trí nằm giữa hai đầu của DNA. Có hơn 90 loại enzyme hạn chế khác nhau. Mỗi người nhận ra một trang web hạn chế riêng biệt. Các enzyme hạn chế phân tách các vị trí hạn chế tương ứng của chúng hiệu quả hơn 5.000 lần so với các trang web khác mà chúng không nhận ra.
Định hướng đúng
Enzim hạn chế có hai loại chung. Họ hoặc cắt DNA thành đầu dính hoặc đầu cùn. Một đầu dính có một vùng nucleotide ngắn, các khối xây dựng của DNA, không ghép đôi. Vùng không ghép đôi này được gọi là phần nhô ra. Phần nhô ra được cho là dính vì nó muốn và sẽ ghép với một phần dính khác có trình tự nhô ra bổ sung. Kết thúc dính giống như cặp song sinh đã mất từ lâu tìm cách ôm nhau thật chặt khi họ gặp nhau. Mặt khác, các đầu cùn không dính vì tất cả các nucleotide đã được ghép nối giữa hai chuỗi DNA. Ưu điểm của đầu dính là một đoạn DNA của con người chỉ có thể phù hợp với một plasmid của vi khuẩn theo một hướng. Ngược lại, nếu cả DNA người và plasmid của vi khuẩn đều có đầu cùn, DNA của người có thể được đưa từ đầu đến đuôi hoặc từ đầu đến đầu vào plasmid.
Ligating kết thúc dính yêu cầu ít DNA
Mặc dù DNA có đầu dính có thời gian tìm thấy nhau dễ dàng hơn vì độ dính của chúng, nhưng không phải đầu dính hay đầu cùn có thể hợp nhất với nhau thành một đoạn DNA liên tục. Sự hình thành một đoạn DNA liên tục hoàn toàn liên kết đòi hỏi một enzyme gọi là ligase. Ligase kết nối xương sống của nucleotide ở đầu dính hoặc cùn, dẫn đến một chuỗi nucleotide liên tục. Bởi vì các đầu dính tìm thấy nhau nhanh hơn do sự hấp dẫn của chúng đối với nhau, quá trình thắt cần ít DNA của con người và DNA plasmid ít hơn. Các đầu cùn của DNA và các plasmid ít có khả năng tìm thấy nhau, và do đó, việc thắt các đầu cùn đòi hỏi phải đưa thêm DNA vào ống nghiệm.
Các enzyme khác nhau có thể cho cùng một kết thúc dính
Các vị trí hạn chế được đặt trong toàn bộ bộ gen của sinh vật, nhưng không cách đều nhau. Trong các plasmid, chúng có thể được thiết kế để nằm ngay cạnh nhau. Các nhà khoa học muốn cắt một đoạn DNA của con người khỏi bộ gen của con người phải tìm ra các vị trí hạn chế ở phía trước và phía sau khu vực của mảnh. Ngoài việc đảm bảo rằng một đoạn DNA được chèn đúng hướng, các enzyme đầu dính khác nhau có thể tạo ra cùng một đầu dính mặc dù chúng nhận ra các chuỗi hạn chế khác nhau. Ví dụ, BamHI, BglII và Sau3A có trình tự nhận dạng khác nhau nhưng tạo ra cùng một kết thúc dính GATC. Điều này làm tăng khả năng sẽ có các trang web hạn chế kết thúc dính bên cạnh gen quan tâm của con người bạn.