NộI Dung
Khi làm việc với sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hiệu chuẩn tốt là vô cùng cần thiết để đảm bảo kết quả chất lượng, đáng tin cậy. Hiệu chuẩn thích hợp của thiết bị HPLC bắt đầu bằng việc tạo ra một tiêu chuẩn hiệu chuẩn phù hợp. Trong hầu hết các trường hợp, hiệu chuẩn trong thực tế đòi hỏi một loạt các tiêu chuẩn về tăng nồng độ để tạo ra cái được gọi là đường chuẩn. Đây là một đường được vẽ và phương trình liên quan mô tả mối quan hệ giữa nồng độ của hóa chất được kiểm tra và phản ứng của máy dò HPLC.
Xác định hóa chất mà bạn muốn kiểm tra để sử dụng HPLC ("chất phân tích"). Ví dụ, bạn có thể muốn thử nghiệm một loạt các loại nước ngọt có hàm lượng fructose, trong trường hợp đó, fructose sẽ là chất phân tích.
Thu được một lượng hóa chất phân tích có độ tinh khiết phù hợp. Thông thường độ tinh khiết phải trên 99% và nên mua chất phân tích từ một công ty cung cấp hóa chất có uy tín. Ví dụ, trong trường hợp fructose, bạn sẽ mua fructose nguyên chất từ một nhà cung cấp hóa chất chứ không phải từ cửa hàng tạp hóa.
Xác định nồng độ tối đa và tối thiểu dự đoán của chất phân tích trong các mẫu bạn định kiểm tra trên HPLC. Trong trường hợp nước giải khát, bạn sẽ kiểm tra nhãn của đồ uống và xác định hàm lượng fructose thấp nhất và cao nhất trong số các loại đồ uống bạn sẽ kiểm tra. Hãy nhớ rằng mẫu ban đầu (nước ngọt) có thể bị pha loãng hoặc bị thao túng trong quá trình chuẩn bị phân tích (tùy thuộc vào phương pháp HPLC được sử dụng) và do đó nồng độ chất phân tích trong các mẫu thực sự được tiêm vào HPLC có thể bị thay đổi. Đó là nồng độ chất phân tích trong các mẫu khi chạy trên HPLC phải được xem xét.
Xác định dung môi mà bạn sẽ hòa tan chất phân tích để tạo thành các tiêu chuẩn hiệu chuẩn. Dung môi này phải có khả năng hòa tan chất phân tích đúng trong phạm vi nồng độ tương đối rộng (ít nhất là cao như trong các mẫu bạn định kiểm tra). Đồng thời, dung môi này lý tưởng là khá giống với "pha động:" dung môi được sử dụng để mang mẫu qua dụng cụ HPLC.
Tính toán lượng chất phân tích cần thiết để tạo ra dung dịch "chuẩn chứng khoán" của chất phân tích. Điều này được tìm thấy bằng cách nhân nồng độ cần thiết của tiêu chuẩn chứng khoán với khối lượng mong muốn. Nồng độ chất phân tích trong dung dịch này phải cao hơn ít nhất 10% so với nồng độ mẫu dự đoán cao nhất. Nếu nồng độ fructose dự đoán cao nhất trong mẫu nước ngọt là 8 gram / 100 ml, thì tiêu chuẩn chứng khoán có thể được thực hiện ở nồng độ 10 gram fructose / 100 ml. Một thể tích hợp lý là 500 ml, do đó, cần phải có 8/100 mL x 500 mL = 40 gram fructose.
Cân lượng chất phân tích cần thiết đến một mức độ chính xác phù hợp. Thường thì giá trị trọng lượng tính bằng gam chính xác đến một hoặc hai chữ số thập phân là phù hợp, nhưng độ chính xác hơn có thể cần thiết cho một số phương pháp.
Chuyển chất phân tích đã cân vào bình định mức có thể tích cần thiết và thêm dung môi mong muốn vào vạch điền vào bình. Sử dụng bình định mức (ví dụ như cốc có vạch chia độ) làm tăng độ chính xác của giá trị nồng độ chuẩn gốc. Đảm bảo rằng tất cả các chất phân tích được chuyển vào bình; sử dụng một số dung môi để rửa nó, nếu cần thiết.
Đậy bình định mức và lắc nhẹ hoặc đảo ngược cho đến khi chất phân tích được hòa tan hoàn toàn.
Tạo một loạt các độ pha loãng khác nhau của tiêu chuẩn chứng khoán bằng cách chuyển các thể tích đã biết của tiêu chuẩn chứng khoán vào các bình định mức, sử dụng pipet để chuyển chính xác, sau đó thêm dung môi. Nồng độ tiêu chuẩn thấp nhất phải thấp hơn mẫu dự đoán thấp nhất sẽ được phân tích. Trong ví dụ về nước ngọt, nếu nồng độ fructose dự kiến thấp nhất trong mẫu là 2 gram / 100 mL, thì có thể tạo ra tiêu chuẩn 1 gram / 100 mL. Điều này sẽ được thực hiện bằng cách pha loãng gấp 10 lần tiêu chuẩn chứng khoán. Sê-ri tiêu chuẩn phải bao gồm tổng cộng 5 hoặc 6 nồng độ, do đó cần pha loãng thêm để tạo ra các tiêu chuẩn có lẽ là 3, 5 và 8 gram fructose / mL. Bây giờ bạn có một loạt các giải pháp tiêu chuẩn để hiệu chỉnh HPLC.